Surveillance de la santé des organes solides après la transplantation utilisant l'ADN sans cellule

Les diagnostics basés sur le cfDNA ont pu rendre la biopsie de tissu obsolète
Biopsies coûteuses et envahissantes de tissu pour détecter le rejet d'allograft après la transplantation pour avoir de nombreuses limitations. Les analyses basées sur ADN sans cellule (cfDNA) — fragments de circulation de l'ADN ont libéré des cellules, tissus, et des organes comme ils subissent la cellule naturelle mort-ont été intensivement étudiés récemment et pourraient finalement améliorer notre capacité de détecter le rejet, l'instrument change plus tôt dans la gestion, et augmente même la survie à long terme des organes transplantés.
Les analyses de CfDNA qui évitent le besoin d'entier-génome ordonnançant (WGS) et le besoin de connaissance a priori des génotypes de distributeur et/ou réceptifs ont des avantages logistiques puissants et sont actuellement sous l'examen minutieux clinique. En outre, l'amélioration de la connaissance de la cinétique organe-spécifique de la transplantation suivante donateur-dérivée du cfDNA (densité double-cfDNA) a également aidé à optimiser ces analyses. Les laboratoires également ont présenté des approches alternatives pour mesurer la densité double-cfDNA, telle que l'amplification en chaîne par réaction numérique de gouttelette (PCR) et les modèles organe-spécifiques de méthylation d'ADN. En soi, le champ des diagnostics d'une façon minimum envahissants basés sur le cfDNA est de plus en plus prometteur, un jour remplaçant potentiellement des biopsies traditionnelles de tissu.
LE RÔLE DE CFDNA DANS LE REJET D'ORGANE
Le rejet, se rapportant à la blessure d'un organe donné provoqué par le système immunitaire du destinataire, peut causer le dysfonctionnement d'allograft et même la mort patiente. Le rejet cellulaire aigu négocié par lymphocyte T (ACR) se produit le plus souvent dans les 6 premiers mois de courrier-greffe (1). L'ACR comporte l'accumulation des lymphocytes T de CD4+ et de CD8+ dans l'espace interstitiel de l'allograft pendant que le système immunitaire du destinataire identifie des antigènes sur l'organe donné comme étranger. Ces lymphocytes T lancent une cascade immunisée qui mène finalement à la mort cellulaire programmée (apoptosis) des cellules visées. Pendant que ces cellules meurent, l'ADN genomic est fendue et des fragments de la densité double-cfDNA, mesurant approximativement 140 paires basses (bp) dans la longueur, sont libérés pour joindre la piscine du cfDNA réceptif dans le sang et finalement excrétés dans l'urine (2).
Le cfDNA de circulation a été récemment accru comme outil de diagnostic pour remplacer des biopsies envahissantes dans d'autres secteurs de médecine, y compris analyser les fragments foetaux d'ADN dans la circulation maternelle pour identifier des anomalies génétiques in utero et séquencer l'ADN de circulation libérée des cellules de tumeur pour identifier des mutations liées au cancer. Dans ces deux cas aussi bien que dans la transplantation, l'ordonnancement de haut-sortie qui identifie et mesure des différences d'ordre d'ADN distingue les deux populations différentes du cfDNA dérivées des sources distinctes (2). Trois caractéristiques de cfDNA lui font un excellent biomarker non envahissant de candidat pour détecter le rejet après la transplantation solide d'organe : Elle peut être obtenue à partir d'une aspiration simple de sang, de sa concentration exactement mesurée, et de sa séquence de nucléotides facilement identifiée. Utilisant le cfDNA comme biomarker pour l'ACR est également avantageux puisqu'il est dérivé des cellules blessées de l'organe donné et devrait donc représenter une mesure directe de mort cellulaire se produisant dans l'allograft. En outre, le cfDNA maintient tous les caractères génétiques de l'ADN genomic originale, permettant le matériel génétique sorti de l'organe donné à différencier du cfDNA dérivé des cellules du destinataire qui subissent l'apoptosis naturel (3).
La surveillance fréquente et précise de la santé d'allograft est essentielle pour la survie à long terme des destinataires de greffe. Pour la transplantation (HT) de coeur, la biopsie endomyocardial (EMB) est l'étalon or actuel pour détecter l'ACR (4). Cependant, EMBs sont coûteux avec des limitations significatives, beaucoup dont soyez commun à toutes les biopsies d'organe (5-7). D'ailleurs, la nature envahissante d'EMBs met des patients de HT en danger pour les complications (6,8,9).
Malheureusement, méthodes non envahissantes actuellement disponibles comprenant l'échocardiographie ou la spécificité suffisante de représentation de manque de résonance magnétique de (MRI) et sensibilité pour détecter sûrement le rejet (10-13). les biomarkers basés sur sang, tels que le cfDNA, représentent une alternative prometteuse qui pourrait être aisément mise en application dans la pratique clinique (14-17).
CINÉTIQUE DE CFDNA PENDANT LA QUIÉTUDE ET LE REJET
Puisque le cfDNA provient du processus naturel de l'apoptosis, toutes les personnes ont les niveaux décelables du cfDNA dans leur sang (18). Pour les personnes en bonne santé, la majorité de cfDNA de circulation vient des cellules hématopoïétiques qui ont subi la mort naturelle liée au chiffre d'affaires cellulaire. Les niveaux du cfDNA flottent pour des raisons multiples comprenant l'infection, la chirurgie, le traumatisme, ou même l'exercice exhaustif (2,19). Par conséquent, développer une analyse basée sur cfDNA pour détecter le rejet exige évaluer la cinétique prévue de la libération densité double-cfDNA dans la courrier-greffe de la circulation du destinataire. Cette considération est particulièrement importante puisque la version au fil du temps de la courrier-greffe densité double-cfDNA est organe-spécifique (20-22).
Par exemple, à 1 courrier-HT de jour le niveau moyen de la densité double-cfDNA est 3,8 le ± 2,3% (20). Cependant, de 7 jours le niveau de la densité double-cfDNA a diminué rapidement et demeure uniformément bas (<1> en revanche, des destinataires des greffes bilatérales de poumon se sont avérés pour avoir une fraction densité double-cfDNA moyenne 26 du ± 14% le premier jour postopératoire. En outre, la réduction de la densité double-cfDNA a été caractérisée par les niveaux de la densité double-cfDNA qui ont diminué rapidement dans la première semaine mais d'autre part ralentie et généralement restée à 1%-3% (21). Cependant, semblable aux greffes de coeur et de rein pendant un épisode de rejet aigu, le niveau de la densité double-cfDNA a grimpé de manière significative, s'élevant jusqu'à une moyenne de 14%-15%.
Les différences dans la masse de tissu et des taux de chiffre d'affaires cellulaire expliquent cette variabilité aux niveaux de la courrier-greffe tôt libérée par densité double-cfDNA et pendant la quiétude. Par exemple, des différences en circulant les niveaux densité double-cfDNA dans les greffes tranquilles bilatérales et de simple-poumon peuvent être expliquées par la différence dans le chiffre d'affaires cellulaire, étant 107 contre 58 cellules/en second lieu, respectivement (21). En revanche, à un coeur transplanté tranquille, le taux de rotation cellulaire est seulement 8 cellules/en second lieu (21-23). Ainsi, une compréhension des niveaux prévus de la densité double-cfDNA liés à un organe solide donné est essentielle pour faciliter le développement des analyses organe-spécifiques qui détectent le rejet. Une fois que la cinétique de la version de cfDNA pour un organe particulier est comprise, plusieurs méthodes existent pour mesurer la quantité relative de densité double-cfDNA.
STRATÉGIES POUR DISTINGUER LE DESTINATAIRE CONTRE DONOR-DERIVED CFDNA
Sexe-disparité de Donateur-destinataire
Pour les greffes d'organe dans lesquelles le donateur est masculin et le destinataire est femelle, les laboratoires peuvent accroître cette disparité de sexe pour calculer les niveaux densité double-cfDNA de toute la piscine du cfDNA du destinataire (17). Les chercheurs ont démontré la première fois la faisabilité de cette approche dans les échantillons d'urine prélevés des destinataires rénaux féminins de greffe qui avaient reçu un rein des donateurs masculins et quand ils ont éprouvé les niveaux élevés démontrés par rejet de la densité double-cfDNA en leur urine qui a spécifiquement contenu des régions trouvées sur le chromosome Y (17). Bien que cette approche tienne compte du diagnostic sûr du rejet dans l'allograft, la sexe-disparité entre le donateur et le destinataire s'applique relativement peu fréquente et pas universellement.
Différences d'ordre d'ADN de Donateur-destinataire
Une greffe d'organe peut également être considérée comme une greffe de génome, car les cellules dans un organe transplanté contiennent l'information génétique de son donateur. En soi, le concept de la dynamique (GTD) de greffe de génome se fonde sur la présence des différences génétiques entre le donateur et le destinataire à un lieu particulier, qui alors peut être accru pour identifier l'origine du cfDNA de circulation (20-24). Dans le meilleur des cas, le destinataire serait homozygote pour une base simple (par exemple, aa) et au même lieu le donateur serait homozygote pour une base différente (par exemple, GG).
Etant donné l'hétérogénéité génétique entre les personnes, des dizaines de milliers de lieux potentiellement instructifs à travers le génome peuvent être interrogées utilisant la haut-sortie ordonnançant pour distinguer la densité double-cfDNA du cfDNA réceptif (20,24). Ce concept a été illustré la première fois utilisant les échantillons encaissés provenant des donateurs cardiaques pour obtenir des génotypes de distributeur a priori pour chaque appareillement de donateur-destinataire. Après l'extraction et l'ordonnancement du cfDNA de chaque destinataire, la fraction des molécules donateur-spécifiques était déterminée. Dans les échantillons prélevés pendant ou juste avant un événement biopsie-prouvé de rejet, la proportion de polymorphismes simples donateur-spécifiques (SNPs) de nucléotide s'est avérée pour avoir augmenté <1>de 3%-4% (24).
Cette étude rétrospective tôt a été maintenant validée pour l'avenir. Des destinataires adultes et pédiatriques de greffe de coeur et de poumon ont été recrutés et des génotypes pour chaque paire de donateur-destinataire ont été obtenus par le GT avec une moyenne de 53 423 marqueurs instructifs de SNP identifiés (20). De façon générale, le dépistage précoce du rejet aigu était supérieur à celui d'AlloMap, la première nourriture et dope l'approche non envahissante Administration-approuvée à détecter l'ACR après le HT basé sur l'analyse de transcriptome (25).
La recherche également a prouvé que le GT fournit non seulement les informations sur une greffe mais également le virome d'un patient et l'état global d'immunosuppression. Ceci représente un avantage potentiellement grand impossible à obtenir par d'autres analyses (26-28).
Cependant, le GT relève les défis qui pourraient l'empêcher d'être mise en application par habitude dans la pratique clinique. Par exemple, alors que l'information génétique d'un destinataire peut être facilement obtenue, cela ne vaut pas toujours pour un donateur. D'ailleurs, le GT est coûteux, de main-d'oeuvre, et long.
Une approche alternative utilise un panneau de SNPs polymorphe genotyped identifié dans la piscine du cfDNA extrait éliminant de ce fait le besoin de connaissance a priori du génotype spécifique d'un donateur (29). À la différence des greffes de rein et de foie, qui se produisent souvent entre les personnes étroitement liées, les paires de donateur-destinataire pour le coeur et les greffes de poumon ne sont pas typiquement connexes. GTD exige genotyping du destinataire et du donateur de greffe. Cependant, dans la pratique, l'information de distributeur de génotype est souvent indisponible. Ici, nous abordons cette question en développant un algorithme qui estime les niveaux densité double-cfDNA faute de génotype de distributeur. Notre algorithme prévoit le rejet d'allograft de coeur et de poumon avec une exactitude qui est semblable à GTD conventionnel. Nous avons en outre raffiné l'algorithme pour manipuler les destinataires et les donateurs étroitement liés, un scénario qui est commun dans la moelle et la greffe du rein. Nous prouvons qu'il est possible d'estimer la densité double-cfDNA dans les greffés de moelle qui sont indépendants ou qui sont des enfants de mêmes parents des donateurs, utilisant un modèle caché de Markov. Par conséquent, des algorithmes ont été développés pour les greffes de coeur et de poumon qui supposent que le génotype du donateur se produit à la même fréquence que la population globale. Basé sur ces fréquences et comparaison au génotype connu du destinataire, la fraction de la densité double-cfDNA peut être sûrement estimée à partir de toute la piscine de cfDNA d'isolement dans l'échantillon du plasma d'un destinataire.
Dans le cas de la transplantation de poumon, ce modèle de simple-génome, une fois comparé à la méthodologie utilisant les génotypes de distributeur et réceptifs, s'est avéré pour fournir les fractions comparables de la densité double-cfDNA. Cependant, quand les chercheurs se sont appliqués cet même algorithme au HT, les niveaux prévus de la densité double-cfDNA n'ont pas été aussi fortement corrélés que dans des greffes de poumon. Ceci pourrait être lié aux quantités absolues inférieures de densité double-cfDNA actuelles après HT. C'est un autre exemple de la cinétique organe-spécifique de cfDNA qui peut influencer des résultats d'analyse et doit être prise en considération (30).
Dans le cas de la transplantation rénale, des études prospectives ont été entreprises de s'assurer l'utilité des niveaux densité double-cfDNA, identifiée utilisant SNPs donateur-spécifique connu, comme marqueur viable pour le rejet. Dans une telle étude, 384 destinataires de rein ont été recrutés de 14 sites cliniques pour fournir des prises de sang à intervalles programmés et à une époque de biopsies médicalement indiquées (31). De façon générale, l'étude s'est concentrée sur la corrélation entre l'histologie dans 107 spécimens de biopsie de 102 patients et les niveaux de la densité double-cfDNA trouvés dans les échantillons assortis de plasma. Plus spécifiquement, 27 échantillons de biopsie provenant de 27 patients présentant le rejet actif ont été obtenus avec 80 échantillons de biopsie provenant de 75 patients sans rejet actif.
Dans cette étude, le rejet actif a inclus le rejet anticorps-négocié aigu (AMR), Amr chronique, et ACR. L'analyse utilisée dans cette étude a utilisé une coupure de 1% pour la fraction de la densité double-cfDNA pour indiquer la présence ou l'absence du rejet actif et s'est avérée avoir la spécificité de 85% (ci de 95%, 79%-91%) et la sensibilité de 59% (ci de 95%, 44%-74%). La sensibilité de cette analyse était plus grande pour distinguer entre l'Amr actif et absent, car l'utilisation d'une coupure de densité double-cfDNA de 1% s'est avérée pour avoir une spécificité de 83% (ci de 95%, 78%-89%) et la sensibilité de 81% (ci de 95%, 67%-100%). Notamment, dans les deux cas, la sensibilité a diminué sensiblement quand la fraction de la densité double-cfDNA a dépassé 3%.
Pour améliorer la spécificité et la sensibilité d'une analyse basée sur cfDNA non envahissante pour détecter le rejet suivre la transplantation rénale, les investigateurs également ont examiné la quantité absolue de densité double-cfDNA (32-33). En interrogeant la quantité absolue de densité double-cfDNA, on peut éliminer les changements artificiels de la fraction de la densité double-cfDNA due aux augmentations des niveaux totaux de cfDNA provoqués par des événements de non-rejet, tels que l'infection, le traumatisme, ou l'exercice, créant potentiellement une analyse plus précise.
Pour étudier cette possibilité, une étude a utilisé 32 variantes instructives (CNVs) de nombre de copie basé sur des fréquences de population, par opposition aux proportions relatives de distributeur et du destinataire SNPs aux lieux donnés (32). On a donc assumé que tout le CNVs non actuel dans le génome d'un destinataire mais présent dans le cfDNA extrait représente la densité double-cfDNA.
Intéressant, alors que la spécificité et la sensibilité s'amélioraient globalement avec l'utilisation des niveaux densité double-cfDNA absolus, cette analyse a également eu une plus grande capacité de distinguer la présence et l'absence de l'Amr actif, par opposition aux cas de l'ACR actif. En outre, les niveaux de créatinine de sérum n'étaient pas suffisants dans la discrimination entre le rejet actif et la quiétude, probables parce qu'elle est plus indicative de la fonction glomérulaire par opposition aux lésions tissulaires de rein (31-33).
Une autre étude a exploré les niveaux absolus de la densité double-cfDNA dans des destinataires de greffe de rein liés aux niveaux du tacrolimus, un immunosuppressant (33). Ici, les chercheurs ont constaté que la quantité absolue de densité double-cfDNA était sensiblement plus haute dans les patients avec le tacrolimus inférieur nivelle (<8> les laboratoires également ont proposé des solutions de rechange au GT. Notre ordonnancement visé exploré par groupe de 124 (fréquence mineure d'allèle [MAF] >0.4) SNPs fortement polymorphe utilisant un panneau disponible dans le commerce, ordonnancement de la deuxième génération, et un algorithme nouvel (34). Cette approche a réduit de manière significative le montant total d'ordonnancer des coûts et le temps exigé et décroissant d'analyse, et permettre l'analyse rapide. Cependant, puisque cette analyse compte sur des différences dans MAF entre les personnes, elle ne serait pas robuste pour des paires étroitement liées de donateur-destinataire, telles que vu dans la donation liée vivre de rein. Elle reste à valider pour détecter des événements modérés ou plus grands de rejet.
Les laboratoires également les ont exploré utilisant SNPs polymorphe pour mesurer la densité double-cfDNA combinée avec la technologie de l'ACP numérique de gouttelette (30,35-37). Utilisant 41 SNPs fortement polymorphe, le rein stable et les destinataires de HT ont montré les fractions densité double-cfDNA de 2%-3% avec les destinataires stables de greffe de foie ayant un niveau de 7% (35).
CONCLUSIONS
L'utilisation d'une biopsie coûteuse et envahissante de tissu de détecter le rejet d'allograft a des limitations significatives. En soi, une analyse d'une façon minimum envahissante qui peut directement et exactement évaluer la santé de l'organe transplanté entier représente un Saint Graal dans la transplantation solide d'organe.
L'utilisation du cfDNA après que la transplantation ait montré une certaine promesse initiale, mais étudient plus loin et la validation est exigée pour améliorer notre compréhension de la biologie de base du cfDNA aussi bien que de sa courrier-greffe de comportement. Actuellement, il est clair que les différences organe-spécifiques importantes existent, et les modèles de la libération de cfDNA peuvent également différer selon le type d'événement de rejet. Cependant, le cfDNA représente un des technologies les plus prometteuses pourtant développé pour compléter ou même remplacer finalement la biopsie de tissu.